石蠟切片(paraffinsection)組織學常規(guī)制片技術中最為廣泛應用的方法。不僅用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結構,也是病理學和法醫(yī)學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態(tài)變化的主要方法,而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。教學中,光鏡下觀察切片標本多數(shù)是石蠟切片法制備的?;畹募毎蚪M織多為無色透明,各種組織間和細胞內各種結構之間均缺乏反差,在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出;組織離開機體后很快就會死亡和產(chǎn)生組織腐敗,失去原有正常結構,因此,組織要經(jīng)固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡,而能清晰辨認其形態(tài)結構。
基本技術
說明
包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與貼片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標本需要數(shù)日,但標本可以長期保存使用,為永久性顯微玻片標本。
取材
應根據(jù)要求選取材料來源及部位。例如植物細胞有絲分裂多選取洋蔥根尖,細胞分裂快又便于切取;豬的肝小葉邊界清晰明確;耳蝸以豚鼠的內耳易于定位和剝離。材料必須新鮮,擱置時間過久則產(chǎn)生蛋白質分解變性,導致細胞自溶及細菌的滋生,而不能反映組織活體時的形態(tài)結構。
固定
用適當?shù)幕瘜W藥液--固定液浸漬切成小塊的新鮮材料,迅速凝固或沉淀細胞和組織中的物質成分、終止細胞的一切代謝過程、防止細胞自溶或組織變化,盡可能保持其活體時的結構。固定能使組織硬化,有利于切片的進行,而且也有媒浸作用,有利于組織著色。固定液的種類很多,其對組織的硬化收縮程度以及組織內蛋白質、脂肪、糖類等物質的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪,甲醛能固定一般組織,但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液。前者有甲醛(乙醛、福爾馬林)、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、鋨酸(四氧化鋨)、重鉻酸鉀及苦味酸等,單一固定液不能固定細胞中的所有成分;混合固定液可以互補不足,常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液(配方見有關技術書籍)。因此,應根據(jù)所要顯示的內容來選擇適宜的固定液。10%福爾馬林(4%甲醛)或10%磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規(guī)使用的固定液,不僅適用于常規(guī)H精-伊紅)染色,還可以用于組織學有關的其他技術的切片染色。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右,固定時間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定,可以從1小時至數(shù)天,通常為1小時至24小時。
洗滌與脫水
固定后的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉淀,否則會影響后期的染色效果。該步驟稱作洗滌多數(shù)用流水沖洗;使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗;使用酒精或酒精混合液固定的組織,則不必洗滌,可直接進行脫水。固定后或洗滌后的組織內充滿水分,若不除去水分則無法進行以后的透明、浸蠟與包埋處理,原因在于透明劑多數(shù)是苯類,苯類和石蠟均不能與水相融合,水分不能脫盡,苯類無法浸入。酒精為常用脫水劑,它既能與水相混合,又能與透明劑相混。為了減少組織材料的急劇收縮,應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行,通常從30%或50%酒精開始,經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精(無水乙醇),每次時間為1~數(shù)小時,如不能及時進行各級脫水,材料可以放在70%酒精中保存,因高濃度酒精易使組織收縮硬化,不宜處理過久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。
郵箱:yilaibo@shyilaibo.com
地址:上海市寶山區(qū)長江南路180號長江軟件園B650